Первые реагенты PCR Transcriptase обратного набора R1011/R1012 синтеза стренги CDNA

RT - набор PCR

Для пользы исследования только

Но. R1011 кота, 20 rxns

Но. R1012 кота, 100 rxns

Компоненты набора

Хранение

Все компоненты набора следует сохранить на -20°C. держат РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ контроля на -70°C для более длинного хранения.

Описание

Набор RT-PCR оптимизирован для того чтобы синтезировать cDNA перво-стренги от очищенное поли (a) + или полной РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Набор RT-PCR для RT-PCR поставляет увеличенные выходы cDNA, высокую чувствительность, и без сокращений транскрипты в удобном формате. Вы получаете все компоненты вам для успешного синтеза cDNA перво-стренги, сохраняющ ваше время и обеспечивающ ваш успех с каждым экспериментом. Набор обратное Transcriptase версия M-MLV RT которое было проектировано для уменьшения деятельности при h рНКазы и для того чтобы обеспечить увеличенную термическую стабильность. Энзим использован для того чтобы синтезировать cDNA на диапазон температур 42-55°C, обеспечивая увеличенную характерность, более высокие выходы cDNA, и более без сокращений продукт чем другие обратные transcriptases.

Применения

Первый синтез cDNA стренги для RT-PCR

Конструкция библиотек cDNA

Одношаговое RT-PCR

Расширение праймера

Важные примечания

Избежание загрязнения рибонуклеазы

Очищенность и целостность РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ необходимы для синтеза без сокращений cDNA. РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА может быть ухудшена рНКазой a, которая сильно стабилизированный загрязняющий елемент найденный в любой окружающей среде лаборатории. Все компоненты набора rigorously были испытаны для обеспечения что они свободны от РНКаз. Предотвратить загрязнение и окружающая среда и реагенты лаборатории, все подготовленные решения должны быть свободны RNases. Общие рекомендации избежать загрязнения рНКазы:

• DEPC-обслуживание все трубки и подсказки пипетки, который нужно использовать в синтезе cDNA или для использования аттестованного свободного от нуклеиназ labware.
• Несите перчатки при регуляции РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ и всех реагентов, по мере того как кожа общедоступный источник RNases. Перчатки изменения часто.
• Используйте свободные от РНКаз реагенты, включая высококачественную воду (например, DEPC-обработанную воду).
• Используйте и АБС битор рНКазы, как Dongsheng RNasin (#R2011) для защиты РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ от работы RNases.
• Держите все компоненты набора плотно загерметизировал когда не в пользе. Держите все трубки плотно закрыл во время обратной реакции транскрипции.

РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА шаблона

Полная клетчатая РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА изолированная стандартными методами соответствующая для пользы с набором. Очищенная РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА должна быть свободна солей, ионов металла, этанола и фенола, который нужно избежать заблокировать реакцию синтеза cDNA. Загрязняющие елементы трассировки могут извлечься высыпанием этанола РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ следовать 2 мыть лепешки с холодным этанолом 75%. Для применений RT-PCR, РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА шаблона должна быть свободна загрязнения ДНК. До синтеза cDNA, РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ можно обработать с DNase i для того чтобы извлечь ничтожные количества ДНК. DNase я должен быть получен потребителем. Всегда выполняйте реакцию контроля (RT-минус) которая включает все компоненты для RT-PCR за исключением обратного энзима transcriptase.

Пищеварение h рНКазы

Чувствительность шага PCR может быть увеличена (особенно для длинных шаблонов) путем извлекать шаблон РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ из cDNA: Молекула РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ гибридная пищеварением с рНКазой h после синтеза перво-стренги. Присутсвие рНКазы h во время синтеза перво-стренги ухудшит шаблон mRNA, приводящ в уменьшенном без сокращений синтезе cDNA и уменьшенных выходах cDNA перво-стренги.

Праймеры

Синтез первого cDNA стренги можно воспламенить с или oligo (dT) праймером 15, случайными праймерами или Джин-специфическими праймерами.

Oligo (dT) 15 воспламеняют синтез cDNA от поли настоящего момента кабеля (a) на 3' - конец eukaryotic mRNA. Случайные праймеры начинают синтез cDNA от полного населения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (rRNA и mRNA). Поэтому, используя случайные праймеры для первых результатов синтеза стренги в большей сложности произведенного cDNA сравненного с oligo (dT) праймером 15. Как следствие, чувствительность и характерность последующих реакций PCR могут быть уменьшены. Однако, несколько применений где полезно использовать случайные праймеры, как синтез cDNA используя mRNAs без поли кабеля (a), или синтез cDNA используя поли (a) - обогащенные образцы РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ.

Джин-специфические праймеры использованы для того чтобы синтезировать специфическое cDNA от бассейна полных РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ или mRNA и должны быть получены потребителем.

Перво- процедура по синтеза cDNA стренги

Перво- реакцию cDNA стренги можно выполнить как индивидуальная реакция или как серия параллельных реакций с различными шаблонами РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Поэтому, смесь реакции может быть подготовлена путем совмещение реагентов индивидуальное или мастерское смешивание содержа все компоненты за исключением РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ шаблона можно подготовить. В зависимости от структуры шаблона РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, отдельные шаги для denaturation РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ и отжиг праймера могут улучшить результаты RT-PCR.

Протокол

I. Первый синтез cDNA стренги

1. Добавьте следующие реагенты в стерильную, свободную от нуклеиназ трубку на льде в показанном заказе:

2. Смешайте нежно, центрифугуйте кратко и инкубируйте на 70°C на 5 MIN. холодка на льде, закрутить вниз и установить пробирку назад на льде.

3. Подготовьте следующее смешивание синтеза cDNA, добавьте следующие компоненты в показанном заказе:

4. Смешайте нежно и центрифугуйте кратко.

5. Для oligo (dT) ₁₅, инкубируйте на минута 60 на 42°C. Для случайного hexamer воспламененный синтез, инкубирует на минута 60 на 37°C.

6. Прекратите реакцию путем нагревать на 70°C на 5 MIN.

Обратный продукт реакции транскрипции можно использовать немедленно во вторых реакциях синтеза cDNA стренги или хранить на -20°C для чем неделю. Для более длинного хранения, -70°C порекомендовано.

II. амплификация PCR первого cDNA стренги

Продукт первого синтеза cDNA стренги можно использовать сразу в PCR или qPCR. Том первой смеси реакции синтеза cDNA стренги не должен состоять из больше чем 1/10 из полного тома реакции PCR. Нормально, μl 2 первой смеси реакции синтеза cDNA стренги использовано как шаблон для последующего PCR в томе 50 μl полном.